香港大学团队突破：METTL3 介导 m⁶A 修饰，靶向转座子增强子调控人类干细胞多能性网络
发布时间：
2025-12-08
香港大学干细胞转化研究中心刘澎涛团队通过构建 METTL3 诱导性敲除（iKO）系统，首次揭示 METTL3 依赖的 m⁶A 甲基化通过抑制灵长类特异性转座子（TEs）活性，调控人类多能性网络的全新机制。
研究发现，METTL3 缺失会激活 SVA_D 和 HERVK/LTR5_Hs 两类转座子，其作为增强子与邻近初始态多能性基因启动子直接互作，导致干细胞滞留于 “超naive” 状态，无法退出多能性并分化，为人类干细胞多能性调控与早期胚胎发育研究提供了全新视角。
标题：METTL3-dependent m6A RNA methylation regulates transposable elements and represses human naïve pluripotency through transposable element-derived enhancers.
译名：METTL3 依赖的 m⁶A RNA 甲基化通过转座子来源的增强子调控转座元件并抑制人类初始态多能性。
期刊：Nucleic acids research
影响因子：IF=13.1
发表时间：2025.4.22
通讯作者:Weiyu Zhang, Haifeng Fu
研究思路
- 先构建 METTL3 iKO 人类扩展潜能干细胞（hEPSCs）模型，规避 METTL3 敲除致死的问题；
- 再通过多组学技术（RNA-seq、MeRIP-seq、ATAC-seq、ChIP-seq 等）解析 METTL3 缺失对基因表达、m⁶A 修饰、染色质状态及转座子活性的影响；
- 随后聚焦 SVA_D 和 LTR5_Hs 两类转座子，探究其被 METTL3 调控的分子机制；
- 最后通过 CRISPR/Cas9 敲除转座子位点，验证其对初始态多能性基因的调控作用，明确 METTL3 - 转座子 - 多能性基因的调控轴。
主要内容
1. METTL3 iKO 系统构建与 hPSCs 功能表型
为研究 METTL3 的必需功能，构建 DOX 诱导的 METTL3 转基因救援敲除系统。结果显示，DOX 撤离后，METTL3 蛋白逐渐消失，m⁶A 修饰水平显著降低（Fig1B-C），MeRIP-seq 证实 10,696 个 m⁶A 峰消失，且富集经典RRACH motif（Fig1D-E）；
METTL3 缺失导致 hPSCs 增殖缺陷，且无法分化为胚胎及胚外谱系，持续表达多能性标志物（Fig1H-K）；在 naive、primed 等不同多能性状态下，均表现出类似增殖与分化缺陷（Fig1G），证实 METTL3 对 hPSCs 维持与分化至关重要。
Fig1、METTL3 是人类多能干细胞维持与分化的必需因子
2. METTL3 缺失增强人类干细胞的初始态多能性
为解析分化缺陷的分子机制，分析转录组变化。结果显示，METTL3 iKO 后，naive 多能性基因显著上调，且该现象不依赖干细胞培养状态（Fig2C-D）；Western blot 证实初始态关键因子 DNMT3L 蛋白水平升高（Fig2E）；多组学分析发现，naive 基因位点染色质可及性增加，抑制性组蛋白标记（H3K9me3、H3K27me3）减少，活性标记（H3K27ac）增加（Fig2G-H）；但 MeRIP-seq 未检测到初始态基因转录本上的 m⁶A 修饰，提示其激活为间接调控（Fig2G）。
Fig2、METTL3 缺失增强人类多能干细胞的初始多能性
3. METTL3 缺失激活 SVA_D 和 LTR5_Hs 转座子的增强子活性
鉴于转座子在多能性网络中的调控作用，分析 METTL3 对转座子的影响。结果显示，METTL3 iKO 后，转座子表达谱显著改变，灵长类特异性的 SVA_D 和 HERVK/LTR5_Hs 转座子表达显著上调（Fig3C-D）；
Western blot 与免疫荧光证实 HERVK Gag 蛋白水平升高（Fig3E-F）；增强子活性预测显示，SVA_D 和 LTR5_Hs 在 METTL3 缺失后获得显著增强子活性（Fig3G），提示其可能调控下游基因表达。
Fig3、METTL3 缺失特异性激活 LTR5_Hs 和 SVA_D 的表达及其增强子活性
4. METTL3 通过维持异染色质抑制 SVA_D 活性
为阐明 METTL3 调控 SVA_D 的机制，开展 m⁶A 修饰与染色质状态分析。结果显示，MeRIP-seq 证实 SVA_D 转录本上存在 m⁶A 修饰，且在 METTL3 缺失后消失（Fig4A-B）；ChIP-seq 显示，SVA_D 位点 H3K9me3（异染色质标记）水平显著降低，H3K27ac（活性染色质标记）升高（Fig4C-E）；METTL3 ChIP-seq 证实其直接结合 SVA_D 位点，且与异染色质相关因子 KAP1、HP1α 存在相互作用（Fig4F-I）；MARGI 数据分析显示，SVA_D 可产生染色质关联 RNA（caRNA），介导 METTL3 招募异染色质复合物（Fig4J-K），证实 METTL3 通过 m⁶A 修饰与异染色质形成，直接抑制 SVA_D 活性。
Fig4、METTL3 通过 H3K9me3 沉积抑制 SVA_D
5. METTL3 缺失通过 TFAP2C 增强 LTR5_Hs 染色质可及性
为解析 LTR5_Hs 的调控机制，分析其 m⁶A 修饰与转录因子结合情况。结果显示，LTR5_Hs 转录本上无显著 m⁶A 修饰，METTL3 也不直接结合其位点（Fig4A、G）；ATAC-seq 证实 METTL3 缺失后，LTR5_Hs 位点染色质可及性显著增加（Fig5A-B）； motif 富集与质谱分析发现，LTR5_Hs 富含初始态多能性转录因子结合基序，且这些因子蛋白水平在 METTL3 缺失后升高（Fig5C）；RNA 半衰期实验证实，TFAP2C、NANOG、SOX2 的 mRNA 稳定性增加（Fig5D）；CRISPR 敲除 TFAP2C 后，STM2457（METTL3 抑制剂）处理无法激活 LTR5_Hs 与 HERVK（Fig5G-H），证实 METTL3 缺失通过延长转录因子 mRNA 半衰期，促进 TFAP2C 等结合 LTR5_Hs，增强其染色质可及性。
Fig5、METTL3 缺失增强 TFAP2C 介导的 LTR5_Hs 染色质可及性
6. 转座子 SVA_D/LTR5_Hs 直接调控初始态多能性基因表达
为验证转座子的功能，通过 4C-seq 与 CRISPR 敲除实验验证。结果显示，4C-seq 证实 SVA_D 与 ZFP42 启动子、LTR5_Hs 与 DNMT3L、ALPG 启动子存在直接互作（Fig6E-G）；
CRISPR/Cas9 敲除 SVA_D 位点后，METTL3 缺失无法激活 ZFP42（Fig7B）；敲除 LTR5_Hs 位点后，DNMT3L 与 ALPG 的激活被阻断（Fig7C-D）；在初始态培养条件下，转座子敲除同样抑制初始态基因激活，证实 SVA_D 和 LTR5_Hs 作为增强子，直接调控邻近初始态多能性基因表达。
Fig6、SVA_D 和 LTR5_Hs 与初始多能性基因相互作用
Fig7、转座子元件敲除以 m⁶A 依赖方式阻断互作初始多能性基因的表达
文章总结
本研究首次揭示 METTL3 依赖的 m⁶A 甲基化调控人类多能干细胞多能性的全新机制，其创新点在于：
- 发现 METTL3 是人类多能干细胞维持与分化的必需因子，与小鼠干细胞中 “METTL3 缺失增强初始态多能性但不影响存活” 存在物种差异；
- 鉴定 SVA_D 和 LTR5_Hs 两类灵长类特异性转座子为 METTL3 的关键调控靶点，且调控机制不同（直接抑制 vs 间接激活）；
- 证实转座子作为增强子与多能性基因启动子互作，构成 METTL3 - 转座子 - 多能性基因的调控轴。
该研究不仅深化了 m⁶A 修饰与转座子在干细胞调控中的作用认知，也为人类早期胚胎发育与再生医学研究提供了新方向。
这套研究思路的普适性极强，可推广至其他表观遗传修饰（如 m⁵C、m¹A）或干细胞类型（如成体干细胞、肿瘤干细胞）：通过构建条件性基因操作模型，结合多组学筛选关键转座子 / 调控元件，探究其染色质调控机制，再通过基因编辑验证功能，最终明确 “表观修饰 - 调控元件 - 功能基因” 的调控网络，为相关领域研究提供可复用的范式。
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