IF 14.6 ! 王继刚/徐承超/王喜军团队应用ABPP化学蛋白质组学揭示新藤黄酸抗脓毒症炎症靶点机制！超详思路值得收藏
发布时间：
2025-11-28
脓毒症是一种危及生命的疾病，由宿主对感染的免疫应答失调引起的，最终导致多器官衰竭。目前的治疗策略高度依赖抗生素。而传统的抗菌治疗常引发抗生素滥用及耐药性问题。因此，开发治疗脓毒症的新型药物至关重要。
新藤黄酸（Gambogenic acid，GNA）是一种从藤黄树脂中提取的天然化合物，具有抗肿瘤和抗纤维化等药理活性，已有研究表明GNA能抑制巨噬细胞中LPS刺激引发的炎症反应。然而，GNA在脓毒症诱导的炎症反应及多器官损伤方面的功效，以及其抗炎作用靶点与分子机制仍不明确。
2025年10月25日，中国中医科学院青蒿素研究中心王继刚/徐承超教授、黑龙江中医药大学王喜军教授团队在Acta Pharmaceutica Sinica B期刊发表题为“Gambogenic acid ameliorates inflammation by inhibiting HK1-mediated Warburg effect and NLRP3 inflammasome activation in sepsis”的研究论文，本研究探讨了GNA在体外和体内的抗炎效果，利用ABPP化学蛋白质组学鉴定到GNA可以直接与己糖激酶1（HK1）的Cys684位点结合，通过减轻HK1介导的Warburg效应和NLRP3炎症小体激活来减轻脓毒症炎症，有望作为脓毒症和炎症性疾病的新型治疗剂。
原名：Gambogenic acid ameliorates inflammation by inhibiting HK1-mediated Warburg effect and NLRP3 inflammasome activation in sepsis
译名：新藤黄酸通过抑制HK1介导的Warburg效应和NLRP3炎症小体激活改善脓毒症炎症
IF：14.6
期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B
发表时间：2025年10月25日
通讯作者： Xijun Wang，Jigang Wang， Chengchao Xu，Huanhuan Pang
DOI：10.1016/j.apsb.2025.10.020
研究结果
GNA可减轻脓毒症小鼠的多器官损伤
构建盲肠结扎穿刺术（CLP）诱导脓毒症小鼠模型以研究GNA保护作用（图1A）。血清生化检测+HE病理染色显示CLP小鼠模型中炎症细胞因子水平显著升高，多器官损伤（包括肺、肝、脾、肠及肾脏）；而GNA处理可显著降低这些细胞因子水平（图1B-E），显著改善多器官病理性状（图1F)。结果表明，GNA能够减轻炎症反应、防止多器官损伤，并提高脓毒症小鼠的存活率（图1G）。
图 1. GNA减轻盲肠结扎穿刺术（CLP）诱导的小鼠多器官损伤
GNA抑制巨噬细胞中炎性细胞因子的释放
利用LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应以探究GNA的抗炎作用，细胞形态观察+炎症细胞因子生化检测+qRT-PCR显示GNA处理可改善LPS处理组的巨噬细胞活化状态，以剂量依赖性方式抑制炎症因子水平，表明GNA可以抑制巨噬细胞中炎症性细胞因子的表达和释放。
图2. GNA抑制脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎症反应
HK1为GNA的潜在作用靶点
为识别GNA的潜在靶点，在LPS刺激的RAW264.7细胞中开展ABPP化学蛋白质组学（图3A-B）。共鉴定到30种差异蛋白（Padj < 0.01 且 |fold change| > 2)为GNA的潜在靶点，其中排名较高的己糖激酶1（HK1）蛋白与糖酵解和Warburg效应密切相关，用于进一步靶点验证（图3C-D）。
细胞热位移实验（CETSA-WB）：随着温度升高，HK1的表达水平逐渐降低，GNA处理显著提升了其热稳定性，表现为GNA处理组HK1表达水平高于DMSO组，表明GNA与HK1之间存在结合作用（图3E-F）。
Pull down-WB：证实DBIA-yne与HK1结合，且该结合可被GNA竞争性（图3G）。
免疫荧光：IAA-yne与原位HK1共定位，且IAA-yne与HK1的结合几乎完全被GNA竞争性抑制（图3H）。
综合来看，这些数据表明GNA可以在LPS刺激的巨噬细胞中与HK1结合。
图3. 基于活性蛋白质分析(ABPP)化学蛋白质组学技术鉴定GNA潜在蛋白靶点
GNA抑制HK1的表达和活性，并减轻Warburg效应
WB+qRT-PCR+酶活性检测显示GNA处理后HK1的蛋白质水平、mRNA水平和催化活性呈剂量依赖性显著下调，表明GNA通过调节HK1的表达水平和催化活性来调节其功能（图4A-D）。
鉴于HK1与Warburg效应之间的密切关联，作者提出假设：GNA的抗炎作用是否通过Warburg效应介导。
乳酸水平+细胞能量代谢检测结果表明GNA可能通过降低HK1的表达和活性来抑制LPS刺激的RAW264.7细胞中有氧糖酵解过程，恢复线粒体呼吸功能，从而缓解Warburg效应（图4F-J）。
图4.GNA抑制HK1并减少LPS诱导的RAW 264.7细胞Warburg效应
HK1蛋白的Cys684残基是GNA的结合位点
小鼠HK1原核蛋白表达+IAA-yne竞争性实验：IAA-yne可以以剂量依赖性方式直接结合HK1蛋白，GNA在HK1蛋白的标记上与IAA-yne有效竞争，其竞争力与IAA相当，表明HK1的反应性半胱氨酸残基是GNA的结合位点（图5A-B）。
分子对接分析：GNA可以结合HK1的Cys684残基位点（图5D）。
蛋白点突变+IAA-yne标记实验：将HK1的Cys684突变为Ala684残基（C684A）。点突变HK1蛋白对GNA结合和IAA竞争均表现出抗性，表明684位的半胱氨酸残基很可能是GNA在HK1上的关键结合位点（图5E）。
生物层干涉测量（BLI）：HK1-WT蛋白与GNA结合并迅速解离，KD=0.139 μmol/L，表明GNA与HK1-WT之间有较强亲和力。而HK1-C684A突变体与GNA结合能力显著降低且解离速率加快，KD=196 mmol/L，表明GNA与HK1-C684A突变体之间的相互作用较弱（图5F-G）。
酶活性检测：HK1-C684A突变体的催化活性显著低于HK1-WT蛋白，Cys684位点是GNA发挥其对HK1抑制效应的关键位点（图5H）。
这些结果表明，GNA与HK1的Cys684残基位点结合并降低HK1的活性。
图5. GNA直接结合HK1蛋白的Cys684位点
GNA调控HK1介导的NLRP3炎症小体激活
为确定GNA是否通过调控线粒体中HK1的解离来缓解LPS刺激巨噬细胞的炎症反应，评估了GNA处理对线粒体和细胞质组分中HK1水平的影响。随着处理时间的增加，LPS刺激会提高细胞质HK1水平，降低线粒体HK1水平；而GNA处理逐渐降低细胞质HK1水平，表明GNA抑制了HK1从线粒体膜上的解离（图6A-B）。
探索GNA抑制HK1解离的下游事件，WB+qRT-PCR+免疫荧光结果显示GNA处理降低了由LPS诱导的Nlrp3、Asc、Casp1和Il1b的蛋白和mRNA水平的高表达（图6C–H）。这些结果表明，LPS诱导HK1与线粒体的解离有助于体外激活NLRP3/Caspase-1/ASC/IL-1β级联反应。
除了GNA通过调节HK1活性缓解Warburg效应的机制外，作者还证明GNA抑制HK1与线粒体膜的解离，降低HK1的细胞质水平，从而抑制NLRP3炎症小体的激活和炎症性细胞因子的释放（图6I）。
图6.GNA通过调控HK1从线粒体解离，抑制NLRP3炎症小体的激活
敲低HK1可减弱LPS刺激巨噬细胞的炎症反应
验证HK1在Warburg效应和NLRP3炎症小体激活中的作用，采用HK1 siRNA转染细胞，敲低HK1降低了细胞外酸化率（ECAR）水平和乳酸水平，证实了HK1在LPS刺激巨噬细胞有氧糖酵解中的调控作用（图7A–F）。
WB+ELISA检测显示HK1敲低降低了LPS刺激的巨噬细胞的炎症反应，GNA处理HK1敲低细胞也有相同下降趋势，证实GNA通过HK1介导的Warburg效应和NLRP3炎症小体激活发挥抗炎作用（图7G–N）。
图7.HK1基因沉默可减轻LPS诱导的RAW264.7细胞中Warburg效应，并抑制NLRP3炎症小体的激活
研究总结：
- 表型验证：新藤黄酸（Gambogenic acid，GNA）体外和体内实验表明，GNA抑制LPS刺激巨噬细胞中炎症性细胞因子的释放，减弱脓毒症小鼠的炎症反应和器官损伤。
- 靶点发现：通过ABPP化学蛋白质组学策略鉴定到30种潜在的GNA靶蛋白，其中排名较高的己糖激酶1（HK1），与糖酵解和Warburg效应密切相关，用于进一步靶点验证。
- 靶点验证：细胞热位移（CETSA-WB）+Pull down-WB+免疫荧光共定位+分子对接分析+生物层干涉测量（BLI）+点突变验证实验证实GNA直接结合于HK1的Cys684残基，影响其酶活性和细胞定位。
- 机制验证：敲低HK1缓解了Warburg效应，抑制了NLRP3炎症小体的激活，最终抑制了炎症性细胞因子的释放。
综合来看，本研究发现表明GNA可以通过减轻HK1介导的Warburg效应和NLRP3炎症小体激活来减轻脓毒症中的炎症，并有望作为脓毒症和炎症性疾病的新型治疗剂。
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