上海中医药大学Redox biology：豆蔻明衍生PROTAC分子选择性降解肝脏KEAP1，激活双信号通路以减轻药物性肝损伤
发布时间：
2026-07-30
药物性肝损伤（DILI）是急性肝衰竭首要诱因，临床干预手段有限，缺乏靶向核心病理（氧化应激、线粒体稳态失衡）的特效药物。KEAP1可同时负调控抗氧化核心NRF2与线粒体质控蛋白PGAM5，但传统KEAP1共价激活剂存在脱靶、肝脏富集差、治疗窗口窄缺陷。
基于此，上海中医药大学葛广波教授团队先筛选出天然产物豆蔻明（CAD）作为KEAP1结合弹头，并以此为基础设计并合成了PROTAC分子8L。8L通过特异性降解肝脏KEAP1，同时激活NRF2和PGAM5，形成“抗氧化+线粒体保护”的协同效应，从而有效缓解药物性肝损伤。
文章信息
标题：Targeted degradation of hepatic KEAP1 mitigates drug-induced liver injury via dual boosting NRF2 and PGAM5 signaling.
译名：肝脏KEAP1靶向降解剂通过双重增强NRF2和PGAM5信号，可减轻药物诱发肝损伤
影响因子：IF=16.3/Q1
期刊：Redox Biology
发表时间：2026年7月11日
研究结果
- 天然产物双筛选，锁定KEAP1结合弹头豆蔻明 (CAD)
为筛选KEAP1结合剂，研究设计了两种策略从200多种天然产物中进行筛选：
NRF2荧光素酶报告基因：看分子能不能激活NRF2（抗氧化通路，功能层面）；
SYPRO Orange热迁移实验：看分子能不能直接结合KEAP1（蛋白结合层面）。
结果：豆蔻明（CAD）可使NRF2活性提升6.22倍，并使KEAP1热位移ΔTm=+3.7°C，SPR验证结合KD=8.79 μM（图1B-C）。CAD的C4位酚羟基修饰后，CAD-1仍保留NRF2激动活性，故选定为PROTAC骨架（图1D-E）。
图1
- CAD衍生PROTAC分子库设计，体外筛选最优降解剂8L
PROTAC分子构建：以CAD为KEAP1配体，以泊马度胺为E3连接酶配体，通过不同长度和类型的连接子（烷基、PEG、含氮杂环），合成了一系列候选PROTAC分子：8A-8M（图2A）。
筛选分子（图2B-N）：在人源肝细胞HepaRG中，流式细胞术和WB显示，8L降解效率最高，呈剂量/时间依赖性降解（DC50=227.2nM），最大降解效率90.5%。在3D肝球模型中同样保持高效降解能力。SPR测得8L与KEAP1的结合亲和力为1.40 μM，比母体CAD提高6倍以上。
细胞毒性与跨细胞系验证（补充图）：10 μM浓度下所有PROTAC分子均无肝细胞毒性。此外，HepG2、Huh7、AML-12多种肝细胞系验证8L稳定降解KEAP1。
图2
3. 降解机制验证
①三元复合物必要性验证：单独CAD、泊马度胺、无CRBN结合能力突变体8L-Me均无法降解KEAP1，仅完整8L起效（图3A-B）；
②降解通路区分：蛋白酶体抑制剂MG132完全阻断降解，自噬抑制剂CQ/Baf无逆转作用，确定降解仅依靠泛素-蛋白酶体通路（图3C-J）；
③E3连接酶依赖性：CRBN竞争剂TD-165部分恢复KEAP1蛋白，证明降解依赖CRBN（图3E-F）；
④降解特异性：无标记定量蛋白组显示仅KEAP1显著下调，其他Kelch同源蛋白无变化，脱靶极低；同时NRF2、PGAM5及下游抗氧化、线粒体调控蛋白同步上调（图3L）；
⑤通路激活证据：三重免疫荧光显示，8L剂量越高，KEAP1荧光越弱，NRF2、PGAM5同步升高（图3M）；
⑥泛素化证据：Co-IP证实8L显著促进KEAP1泛素化修饰（补充图）。
小结：8L经CRBN介导的泛素化途径选择性降解KEAP1，同时激活NRF2、PGAM5。
图3
4. 细胞功能与机制验证
构建顺铂（CDDP）和对乙酰氨基酚（APAP）两种经典肝细胞损伤模型，分两大维度验证8L保肝功能，全程与母体CAD平行对照：
维度1：整体细胞存活与氧化应激
- 细胞活力：APAP/CDDP造模后细胞活力大幅下降，8L剂量依赖性恢复存活，药效显著优于同浓度CAD（图4A-B）；
- 抗氧化：8L降低LDH释放、提升GSH/GSSG比值、上调SOD抗氧化酶，显著清除细胞总ROS，减少药物诱导肝细胞凋亡（图4C-H）。
维度2：线粒体质控系统修复
- 线粒体形态：CDDP诱导线粒体碎片化，8L恢复完整网状线粒体结构（图5A-B）；
- 线粒体功能：恢复膜电位、抑制线粒体通透性转换孔MPTP开放、降低线粒体超氧mtROS、阻断线粒体钙超载（图5C-G）；
- 线粒体自噬：线粒体-溶酶体融合荧光实验证实，8L提升线粒体自噬通量，清除受损线粒体（补充图）；
机制验证
- 蛋白水平：8L上调NRF2/PGAM5、线粒体生物合成（PGC-1α、TFAM）、线粒体融合蛋白MFN2/OPA1、线粒体自噬PINK1/Parkin，下调裂变蛋白DRP1（图6A-D）；
- 双通路验证：单独敲低NRF2或PGAM5只能部分逆转8L对线粒体的保护作用，而同时敲低两者则几乎完全消除了8L改善效果（图6E-H）。
小结：8L降解KEAP 后，NRF2抗氧化通路+PGAM5线粒体质控通路协同作用，单一条通路激活无法实现完整肝细胞保护效果。
图4
图5
图6
- 体内安全性及肝脏靶向性评价
代谢稳定性：人肝微粒体Ⅰ相（NADPH）和Ⅱ相（UDPGA）代谢体系中，8L降解速率远慢于CAD，体内半衰期更长（图7A-B）；
组织靶向分布：小鼠腹腔给药后，88.99%药物富集于肝脏，肝内药物浓度是脾脏、肾脏14倍以上，质谱成像直观显示肝脏特异性富集（图7C）；
安全性：50 mg/kg高剂量持续给药，小鼠体重无下降、无死亡；肝肾功能、血脂血清指标无异常；多脏器HE病理切片无炎症、坏死损伤（图7D-F）。
小结：8L代谢稳定、肝脏靶向富集、长期给药无脏器毒性，具备体内治疗给药基础。
图7
- 体内药效与机制验证
搭建两套临床高度相关DILI小鼠模型，设置低/中/高给药梯度，同步对比CAD治疗效果：
模型1：顺铂CDDP诱导肝肾联合损伤
- 整体表型：CDDP造成小鼠体重下降，8L梯度恢复体重；肝组织HE显示减轻肝细胞损伤、炎性浸润和肝窦紊乱，同时减轻肾损伤（图8A-C）；
- 生化指标：显著下调肝损伤标志物ALT/AST、肾损伤肌酐/尿素氮；提升肝组织GSH/GSSG、SOD，降低氧化产物MDA、LDH，肾组织类似（图8D-K）。
模型2：对乙酰氨基酚APAP诱导的急性肝损伤
- 组织病理：8L同样恢复体重，改善肝细胞肿胀、大片凝固性坏死（图9A-C）；
- 生化指标：降低ALT/AST、LDH/MDA，升高SOD/GSH（图9E-I）；
- 超微结构：TEM显示8L诱导线粒体自噬，挽救APAP引起的线粒体破裂、嵴消失和数量减少（图9J）。
机制确证（图10）：取小鼠肝组织进行WB，发现8L剂量依赖性下调KEAP1，上调NRF2/HO-1和PGAM5。同时上调线粒体质量控制（MQC）相关蛋白。
为排除8L脱靶起效可能性，采用肝细胞特异性KEAP1条件敲除小鼠反向验证：
- 造模结果：敲除小鼠注射APAP后依旧出现体重下降、ALT/AST升高、肝细胞坏死、氧化失衡；
- 给药结果：给药最高剂量8L，所有肝损伤、氧化应激指标无任何改善，抗氧化酶SOD、GSH无法恢复（补充图）。
小结：8L在体内通过特异性降解KEAP1，同时激活NRF2抗氧化通路和PGAM5介导的MQC修复网络，以缓解药物诱导的肝损伤。
图8
图9
研究总结
本文研究逻辑清晰：从表型筛选天然产物出发→确定CAD为可修饰的KEAP1结合剂→合理设计PROTAC库并优化连接子与取代位置→获得高活性、高选择性的肝富集降解剂8L→系统验证其通过CRBN介导的蛋白酶体途径降解KEAP1→在细胞和动物水平证明其双重激活NRF2和PGAM5，协同修复氧化还原与线粒体稳态→通过肝脏特异性基因敲除确证靶向依赖性。
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