王继刚团队化学蛋白质组学揭示，天然产物藤黄酸通过共价抑制SHMT2酶，破坏三阴性乳腺癌线粒体功能以诱导铁死亡
发布时间：
2026-07-30
今天介绍一篇发表在《Advanced Science》（2026年）上的研究，该文聚焦三阴性乳腺癌（TNBC）缺乏有效靶点这一临床难题，从天然产物藤黄酸（GA）入手，利用化学蛋白质组学技术锁定了线粒体一碳代谢关键酶SHMT2。
研究完整阐明了“GA共价结合SHMT2 Cys241→阻断SHMT2四聚体化、抑制其酶活→线粒体功能崩塌→Nrf2/HO-1通路激活→铁死亡”的全新调控轴。做天然产物靶点发现、铁死亡、线粒体代谢、老药新用的朋友，值得精读。
文章信息
标题：Covalent Inhibition of SHMT2 by Gambogic Acid Induces Ferroptosis Through Mitochondrial Collapse in Triple-Negative Breast Cancer.
译名：藤黄酸共价抑制SHMT2通过诱导线粒体崩溃，触发三阴性乳腺癌铁死亡
影响因子：IF=14.6/Q1
期刊：Advanced Science
发表时间：2026年6月30日
思路拆解
第一步：体外内实验，确认GAGA选择性抑制三阴性乳腺癌
在探索机制前，需要先确立GA疗效：
体外高敏：CCK-8实验测了不同细胞对GA的敏感性。结果发现，GA对几种TNBC细胞（MDA-MB-231、Hs578T、4T1）的杀伤力极强（IC50＜1 µM），但对正常细胞或其他亚型影响小（图1B）。
功能抑制：克隆形成、划痕、Transwell和流式实验，证明GA能抑制TNBC细胞增殖、迁移、侵袭，诱导凋亡（图1E-1J，K-L）。
3D类器官：在多细胞肿瘤球（MCTS）模型中，GA显著缩小肿瘤体积并增加死细胞比例，模拟了实体瘤环境下的药效（图1M）。
体内药效：在4T1原位瘤及肺转移模型中，GA不仅显著抑制原发灶生长（效果优于紫杉醇），还大幅减少了肺转移结节（图2B-J）。HE和Ki-67染色也从组织层面证实了这点（图2F）。
图1
图2
第二步：化学蛋白质组学鉴定靶点：SHMT2是GA的核心共价靶点
GA结构里有一个α, β-不饱和羰基，可共价结合蛋白半胱氨酸巯基。半胱氨酸探针IAA-P标记实验证明GA确实在细胞内与探针竞争结合半胱氨酸，呈剂量依赖性（图3B）。
作者利用这一特性，设计了竞争性化学蛋白质组学策略：不改造GA分子，而是使用通用的半胱氨酸探针DBIA，实验逻辑如下：
- 对照组：用DBIA探针标记TNBC细胞中所有活性Cys位点→质谱检测到大量被标记的蛋白信号
- GA处理组：先用GA处理细胞，占据靶点Cys→再用DBIA探针标记→此时已被GA占据的Cys位点无法再被DBIA标记→质谱信号"消失"
- 对比分析：两组质谱数据做差异分析，找出信号显著下降（即被GA"竞争掉"）的蛋白，就是GA的潜在结合靶点。
筛选结果：SHMT2是竞争结合最强的蛋白、呈剂量依赖性，且功能与GA敏感靶点生信分析结果一致：亚细胞定位富集线粒体，富集于线粒体一碳代谢通路（图3C-F）。
互作验证：免疫荧光、细胞原位pull-down、CETSA、体外重组蛋白实验证明GA直接结合SHMT2，且只结合SHMT2、不结合同源SHMT1（图3G-J，图4A-B）。
图3
第三步：靶点-药物结合机制：GA共价结合SHMT2 Cys241，阻断四聚体组装
只找到靶点不够，必须说清楚“怎么结合”和“结合后产生什么功能后果”，这才是机制深度的体现。
结合位点鉴定：质谱直接鉴定出GA共价修饰Cys241，分子对接显示GA的α,β-不饱和羰基与Cys241巯基共价连接。凝胶荧光显示该位点突变后IAA-P标记信号大幅减弱，GA无法竞争。MST显示GA与SHMT2的强相互作用在C241A突变体中被显著减弱（图4C-E）。
结合机制：酶活测定实验发现，GA剂量依赖抑制SHMT2酶活，C241突变大幅降低酶活。CD光谱显示GA改变蛋白二级结构，化学交联（DSS）证实GA阻断SHMT2无活性单体向活性四聚体转化（图4F-K）。
以上表明：GA通过共价结合SHMT2 Cys241，改变蛋白构象、破坏四聚体组装，抑制SHMT2酶活性（图4L）。
图4
第四步：全局蛋白质组学揭示线粒体功能障碍与铁死亡是核心下游事件
SHMT2失活后，细胞发生了什么？作者采用了无偏好的TMT定量蛋白组学进行全景扫描。
TMT标记定量蛋白质组学线索：鉴定到690个下调蛋白、325个上调蛋白。最引人注目的是HO-1上调近60倍。GSEA富集显示氧化磷酸化、线粒体呼吸通路显著抑制，Keap1-Nrf2、铁死亡通路显著激活，GO/KEGG分析交叉验证（图5A-G）。
线粒体功能验证：Seahorse检测证实GA抑制细胞呼吸速率，生化实验显示GA处理后氧化还原失衡（NAD+/NADH比值下降）、ATP耗竭、抗氧化GSH大量消耗、膜电位消散，结构崩坏（线粒体碎片化、嵴破坏）（图6A-N）。
Nrf2通路激活验证：WB显示GA剂量依赖性下调Keap1，上调Nrf2、HO-1、NQO1（图7A-B）。
铁死亡确证：FerroOrange/流式证明GA提升胞内游离Fe2+；BODIPY C11共聚焦/流式、4-HNE免疫组化、MDA检测证实GA显著升高脂质过氧化物。TEM观察到铁死亡典型特征：线粒体（体积缩小、嵴消失、外膜破裂）（图7C-J）。
挽救实验：铁螯合剂DFO、脂质抗氧化Lip-1、GSH前体NAC均可逆转GA诱导的细胞铁死亡（图7K-N）。时序抑制剂实验证明铁死亡是早期主要事件，凋亡是后续附带效应。
以上表明：GA结合SHMT2→SHMT2酶活抑制→线粒体崩溃→Nrf2/HO-1激活→Fe2+释放、脂质过氧化→铁死亡。
图5
图6
图7
第五步：靶点功能验证与临床相关性
为了证明SHMT2确实是GA发挥药效的关键，且具备临床价值：
体外敏感性：CCK-8显示SHMT2敲除细胞对GA杀伤显著不敏感，在低SHMT2细胞中过表达SHMT2后GA敏感性回升（图8A-B）。
机制验证：SHMT2敲除可激活Nrf2通路、升高Fe2+/脂质过氧化/MDA、降低GSH，GA无法进一步加剧这些效应（图8D-M）。
功能验证：SHMT2敲除显著抑制TNBC增殖、克隆、侵袭、3D肿瘤球生长（图8A-B，9E-S）。同样，体内SHMT2敲低削弱GA的抑瘤效果（图8C）。表明GA的抗TNBC效应确实是通过抑制SHMT2介导的。
临床相关性：多细胞WB、TCGA/GSE公共数据库证明SHMT2在TNBC、ER阴性乳腺癌特异性高表达，生存曲线显示SHMT2高表达患者总生存期显著缩短（图9A-C）。
图8
图9
【本文研究思路复盘】
1. 表型确认：确立GA对TNBC的高选择性杀伤（CCK8,克隆形成, 3D类器官,动物模型）。
2. 靶点鉴定：利用竞争性化学蛋白质组学，在不修饰药物的情况下精准捕获直接靶点SHMT2。
3. 结合机制解析（分子水平）：结合质谱、MST、分子对接、突变体回补，在原子层面解析了GA结合Cys241抑制SHMT2酶活及寡聚化的机制。
4. 作用机制解析（细胞水平）：通过TMT蛋白组学筛选下游通路，结合线粒体功能、铁死亡检测实验，证实了“线粒体损伤-铁死亡”轴。
5. 靶点功能确证与临床相关性：利用shRNA基因编辑和临床数据库，确证靶点必要性并挖掘其临床转化价值。
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