首都医科大学ABPP揭示中药活性成分川芎嗪通过靶向Trx1蛋白，改善缺血性脑卒中
发布时间：
2026-06-30
缺血性脑卒中治疗困境：溶栓后的大脑反而会因“再灌注损伤”而雪上加霜，其中硝化应激导致的蛋白酪氨酸硝化是关键推手。中药单体川芎嗪（TMP）是我国应用数十年的卒中治疗药物，疗效确切，但它的直接靶点和作用机制始终是谜。
6月4日，首都医科大学使用定量蛋白质组学（SILAC-ABPP）发现，抗氧化蛋白Trx1为川芎嗪的直接靶点，通过结合Trx1 Y49位点，抑制其硝化失活、变构激活Trx1，进而阻断下游促凋亡信号通路，以高效保护缺血性脑卒中神经元。
文章标题：Allosteric activation of Trx1 by antagonizing nitrative modification at tyrosine 49 confers neuroprotection against ischemic stroke.
译名：通过拮抗酪氨酸49位硝化修饰的变构激活Trx1，从而在缺血性脑卒中中发挥神经保护作用
影响因子：IF=11.9/Q1
期刊：Redox Biology
发表时间：2026年6月4日
研究结果
- 川芎嗪（TMP）药效验证
体内效果：构建大鼠大脑中动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）模型，腹腔注射TMP。结果显示，显著降低了神经功能缺损评分，缩小脑梗死面积（图1A-C）。通过脑组织染色（HE和Nissl染色）显示，保护了神经元结构，减少了细胞皱缩和坏死（图1D-E）。这说明川芎嗪在体内确实有神经保护作用。
体外疗效：使用原代海马神经元、SH-SY5Y细胞构建氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型，TMP浓度依赖性地提高细胞存活率、保护突触完整性与线粒体膜电位、降低ROS、减少染色质凝集与核固缩（图2A-E）。表明TMP通过保护线粒体功能、减少氧化应激和凋亡发挥体外神经保护作用。
图1
图2
- SILAC-ABPP鉴定TMP直接靶点
为了找到川芎嗪到底结合哪个蛋白，研究先合成了一种光亲和探针（叫TMP-P），其其活性与TMP相当（图3A-B）。
然后采用SILAC-ABPP技术：一组细胞用轻同位素标记，只加探针；另一组用重同位素标记，先加过量川芎嗪再加探针（竞争）。通过质谱分析，找到那些被过量川芎嗪竞争掉的蛋白（过滤条件Light/Heavy比值>1.5且p<0.05，图3C-D）。
再结合脑缺血相关基因数据库，筛选出两个候选蛋白：Trx1和FABP5。进一步用MST与免疫荧光确定，Trx1是川芎嗪的直接靶点（图3E-H）。
图3
- 靶点功能验证
结合验证：竞争性pull-down显示，游离TMP可剂量依赖性阻断TMP-P与Trx1结合（图4A）。DARTS和CETSA技术，发现TMP只保护Trx1免受蛋白酶降解或热变性，而对TrxR1、Keap1、VDAC1无影响（图4A-D）。
功能验证：CRISPR/Cas9基因敲除Trx1，再用川芎嗪处理，发现川芎嗪完全失去了保护细胞活力、减少核损伤和线粒体损伤的能力（图4E-G）。证明Trx1是川芎嗪发挥神经保护功能的必需靶点。
图4
- 机制深挖：TMP如何调控Trx1功能？
①判断调控方式：作者观察到，在OGD/R细胞模型中，Trx1酶活性被显著抑制，TMP可恢复其活性，但均不改变Trx1总蛋白表达，表明调控发生在翻译后修饰层面（图5A-B）。
②锁定关键翻译后修饰：
首先定位结合位点：用TMP-P光交联后，LC-MS/MS鉴定到7个修饰残基（S44、S46、E47、L97、E98、E103、L104），全部簇拥在Y49周围（图5D-E）。而Y49恰好是已知可被硝基化修饰的位点，这会抑制Trx1活性。
随后实验证实：OGD/R确实引起Y49发生硝化，而TMP处理显著降低了这一硝化水平（图5F）。且Y49突变后TMP结合力下降，且完全无法激活Trx1，也无法保护线粒体和抗凋亡（图5G-H）。
③变构机制解析：研究发现Y49远离Trx1催化活性中心，推断为变构调控。使用色氨酸荧光淬灭和CD证实TMP诱导了Trx1的构象变化，分子动力学模拟进一步显示TMP结合后C32和C35之间的距离增大（图5I-M），这有利于保持Trx1的还原活性状态。
综合以上证据，该研究得出结论：TMP通过结合于Trx1的Y49位点，阻止该位点的硝基化修饰，并通过变构效应激活Trx1。
图5
- 下游信号通路解析
Trx1被激活后，必然要影响其下游效应分子。已知Trx1能结合并抑制ASK1，接着验证此通路：Co-IP与WB显示，TMP恢复OGD/R破坏的Trx1-ASK1结合，抑制ASK1、p38、JNK磷酸化；Y49A突变使Trx1无法结合ASK1（图6A-D）。
敲除ASK1后TMP失去保护作用（图6E-G）。在Trx1-KO或ASK1-KO细胞中，TMP均不能抑制下游磷酸化（图6H-I）。表明TMP通过Trx1-ASK1-p38/JNK轴发挥抗凋亡作用。
图6
- 体内验证机制通路
体外机制成立后，必须回归动物体内验证；同时引入反向药理学干预（人为加重硝化应激），做“正向+反向”双重验证，形成完整逻辑闭环，这是高分论文的标配。
正向体内验证：在MCAO/R大鼠脑组织中，重复体外核心指标：Trx1硝化水平、Trx1酶活、Trx1-ASK1结合、通路蛋白表达，结果与细胞实验完全一致（图7A-D）。
反向干预：引入SIN-1（过氧亚硝基供体），人为诱导蛋白硝化：发现其阻断TMP对Trx1硝化的抑制、逆转Trx1活性恢复；同时在动物层面，抵消TMP缩小梗死、改善神经功能、保护神经元的作用，重启凋亡通路（图7E-L）。
图7
文章总结
这篇文章完整呈现了“药效确认（体内/外模型）→靶点筛选（SILAC-ABPP化学蛋白质组学）→结合验证（MST, CETSA, 共定位）→靶点功能验证（基因敲除）→机制解析（位点鉴定、质谱PTM分析、分子模拟）→信号通路下游确证（Co-IP, WB）→体内机制闭环（药理学干预）”的完整研究逻辑：不仅找到了中药单体的作用靶点与结合位点，还阐明了全新的作用机制。
全文整体创新
靶点新：锁定川芎嗪直接作用靶点Trx1，破解经典中药单体机制难题
位点新：发现Trx1 Y49全新变构成药位点，开辟药物研发新方向
机制新：提出“抗硝化修饰+变构激活”双重调控模式
实验设计可借鉴亮点
模型体系完整：体内动物+细胞模型，正向药效+反向药理学干预，逻辑闭环
靶点验证体系严谨：亲和力（MST）+活细胞互作（DARTS/CETSA）+基因敲除（功能必需），多技术交叉验证，避免单一实验结论
位点验证标准：质谱定位+点突变+功能回补，是翻译后修饰、蛋白结合位点研究的金标准流程
机制分层清晰：表型→靶点→修饰→构象→通路，由浅入深
研究局限
位点验证局限：未构建Trx1 Y49定点敲入/敲除基因编辑动物，无法在真实病理环境中直接验证该位点对川芎嗪药效的决定性作用，体内位点功能证据不足
结构解析局限：仅依靠分子对接与分子动力学模拟预测川芎与 Trx1 的结合模式及蛋白构象变化，缺乏蛋白-小分子复合物晶体结构/冷冻电镜三维结构的直观原子水平证据，难以精准阐释变构效应的结构基础
靶点网络局限：ABPP筛选得到了上百个候选蛋白，本研究仅聚焦核心靶点Trx1。川芎嗪作为中药天然产物具备多靶点特性，其余潜在作用蛋白、协同调控通路未开展深入研究，未能完整勾勒其作用网络
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