化学蛋白组学技术
化学蛋白组学技术
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化学蛋白组学技术
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在不改变小分子化合物的活性的前提下，将小分子化合物改造为含有蛋白富集标签或点击反应基团的活性分子探针，并直接处理活体细胞。活性分子探针会与靶点蛋白相互作用，并通过亲和磁珠将富集细胞内与小分子化合物互作的蛋白，利用蛋白质组学分析鉴定出蛋白靶标，并通过结构分析其结合位点。
1 、小分子化合物的确定。
小分子化合物通常是指相对分子量小于 1500Da 的化合物，可以是化药小分子、中药活性单体、天然产物以及体内的内源性代谢小分子。小分子信息的来源 包括但不限于查阅相关的文献资料、代谢组学鉴定分析出的差异代谢物、本课题组其他途径获取等等。小分子化合物获取途径包括但不限于市场采购、提取分离以及从头合成。
2 、活性探针的设计合成(小分子化合物的改造)
在小分子化合物易于改造的官能基团(如羟基、氨基、卤素等)上添加光亲和标记(双吖丙啶)和炔基。光亲和标记的原理是在紫外光照下激活后的卡宾活 性位点与附近蛋白上的 C-H 键进行共价交联，从而更利于捕捉目标蛋白。炔基是为了和叠氮生物素发生点击化学反应，从而偶联上生物素标签。生物素是一种天然辅酶，可与链霉亲和素紧密结合。这种强相互作用能够轻松地将带有生物素标记的蛋白质纯化出来并进行鉴定。
3 、细胞实验
使用探针处理细胞，紫外交联，点击化学反应，亲和纯化富集小分子互作蛋 白。
该实验设置 3 个组：探针组、阴性对照组和竞争组。探针组就是探针本身，是为了钩钓小分子的结合蛋白;阴性对照组是加入 DMSO 或者原分子，是为了 去除生物素本身结合蛋白等背景蛋白;竞争组在探针组的浓度下，同时加入大量的原分子，原分子会和探针竞争结合其特异性集合蛋白，这样竞争处理组和处理组比较分析得到的差异蛋白就是小分子的特异性结合蛋白。
该实验首先通过胶内荧光实验确定探针的佳蛋白结合浓度以及最佳竞争浓度，然后每组设置 3 个生物学重复，共计 9 个样品进行蛋白质谱检测。
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组别 |
内容 |
数量 |
备注 |
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处理组 |
探针 |
3 |
钓取小分子结合蛋白 |
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阴性对照组 |
DMSO |
3 |
排除生物素本身结合蛋白 |
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竞争组 |
探针+原分子 |
3 |
筛选特异性结合蛋白 |
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总计 |
|
9 |
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4 、蛋白质谱检测
上述 9 个样品进行质谱检测，比较分析，得到小分子结合蛋白，从中筛选出候选靶蛋白，进行后续功能验证实验(蛋白靶标筛选和验证需单独制定方案)。
- 创新药靶点机理研究
- 中药单体靶点研究
- 老药新用靶点研究
- 疾病机理研究
- 生物体自身代谢小分子互作蛋白机理研究
- 活细胞内原位反映化合物与蛋白互作情况;
- 相较于传统组学，精准找到小分子互作靶点蛋白;
- 小分子改造-细胞实验-靶点发现，一站式服务;
- 拥有化学和生物学海归博士团队，完美的将化学和生物学结合，让科研不再内卷!
1. Low-dose metformin targets the lysosomal AMPK pathway through PEN2. 2022, Nature, IF = 69.504.
二甲双胍(Met)是治疗二型糖尿病的一线药物，同时研究也显示出其他功效，如抗衰老和抗癌作用，临床剂量的 Met 可以充分抑制溶酶体上的 v-ATP 酶，发挥功能。
本研究为寻找 Met 的直接分子靶点，首先设计合成 Met 光亲和探针(Met-P),与溶酶体裂解物孵育后进行蛋白质组分析，确定靶点蛋白为 PEN2(γ-分泌酶的亚基)。接下来探究 Met 结合 PEN2 后如何抑制 v-ATP 酶，将 PEN2 的结合蛋白进行质谱分析，选择 ATP6AP1 (v-ATP 酶的亚基)作为进一步研究对象，通过计算机模拟、突变体构建等确认二甲双胍与 PEN2 结合，并通过 ATP6AP1 启动交叉信号通路。最后，在肝脏、肠道以及秀丽隐杆线虫中，探索了 PEN2 和 ATP6AP1 介导的二甲双胍的功效。本研究确定了 PEN2 是 Met 的分子靶点，Met-PEN2-ATP6AP1 轴为筛选二甲双胍替代物提供了潜在靶点。
2.Celastrol mitigates inflammation in sepsis by inhibiting the PKM2-dependent Warburg effect., 2022, Military Medical Research,IF=34.915
雷公藤红素(Celastrol, Cel)是传统中药雷公藤中的一种天然中药单体，具有抗炎以及作为免疫抑制剂的生物活性，被《Cell》评为最有可能也最值得开发为现代药物的五种天然化 合物之一。
本研究为探讨 Cel 在内毒素血症和脓毒症模型中的药理活性及分子机制，首先在内毒素血症和脓毒症小鼠以及细胞水平评估了 Cel 的药理学活性，确认 Cel 可改善肺纤维化。作者通过化学改造合成了 Cel 探针(Cel-P),使用基于活性的蛋白组(ABPP)技术筛选了 Cel 的潜在蛋白靶点。发现： 丙酮酸激酶 M2 (PKM2) 、高迁移率族蛋白 B1 (HMGB1) 、乳酸脱氢酶 A (LDHA)三者都是 Cel 的直接作用靶点。接着利用细胞热位移分析(CETSA)和表面等离子体共振(SPR)对三种靶点进行验证。通过点突变技术和基因敲低实验探究 Cel 与靶点蛋白的具体结合位点。本研究确认了 Cel 通过抑制炎症反应和促进 Warburg 效应减轻脓毒症引起的组织损伤的分子生物学机理，为探索 Cel 的具体作用机制、给药浓度和给药时机，提供了前期数据支持。
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