邻近标记技术介绍
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邻近标记技术介绍
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邻近标记(PL ，Proximity-based Labeling)技术是一种用于筛选蛋白质-蛋白质 相互作用(PPI)的新兴技术。邻近标记的原理是将一个具有邻近标记功能的酶 (biotin ligase) 与目标蛋白融合，通过酶催化的共价修饰将与诱饵蛋白邻近的蛋白 标记上生物素，最后通过亲和素磁珠富集生物素标记蛋白进行质谱鉴定。生物素 是一种天然辅酶，可与糖蛋白、亲和素或类似的蛋白质、链霉亲和素紧密结合。 这种强相互作用能够轻松地将带有生物素标记的蛋白质纯化出来并进行鉴定。
- 目标蛋白的相互作用蛋白研究
- 疾病关键蛋白或者药物靶点蛋白的相互作用蛋白研究
- 新的标志物或者靶点蛋白发现
- 组织特异性分泌蛋白研究
1 、 载体构建
构建目标蛋白-HA-turboID 融合表达质粒。HA 标签用于检测融合蛋白是否 在细胞中顺利表达。
2 、 表达细胞系构建
将载体转入细胞系中，使融合蛋白在细胞系中稳定表达。通过 HA 标签检测 融合蛋白是否在细胞系中表达。细胞需要是针对研究内容的细胞系模型，需要能 够进行转化实验。该实验设置处理组和对照组，处理组是正常的融合蛋白表达， 对照组是不含目的基因的对照质粒进行表达，目的是为了去除turbo ID 本身的结 合蛋白。
3 、 生物素化处理
此步骤是给定适当的催化条件，让目标蛋白邻近的蛋白标记上生物素，并通 过链霉亲和素磁珠进行亲和纯化，富集蛋白。
4 、 蛋白质谱检测
以上两组各设置 3 个生物学重复，共计 6 个样品进行蛋白质组学检测，并分析鉴定出目标蛋白的互作蛋白。
- 替代 co-IP ，无需抗体;
- 可以检测微弱、瞬时的蛋白相互作用;
- 在活细胞体内原位标记目标蛋白邻近蛋白。
1.Snx14 proximity labeling reveals a role in saturated fatty acid metabolism and ER homeostasis defective in SCAR20 disease. 2020, PNAS, IF = 12.779
脂肪酸(FAs)是促进脂类合成的中心细胞代谢物，FA 加工和储存的失调会导致代谢和神 经紊乱，饱和脂质(SFA)对细胞危害尤甚，但脂质饱和水平是如何维持的仍然知之甚少。 该研究首先发现在小脑性共济失调 SCAR20 疾病相关蛋白 Snx14 ，是一种内质网- 脂滴 (ER-LD)栓系蛋白，也是维持细胞膜脂质饱和平衡所需的因子。SFA 可使 SNX14 KO 细胞内 质网络完整性受损。该研究构建 Snx14 邻近标记体系，揭示了 ER-LD 接触点 Snx14 相关的 蛋白质组成，并确定了 Snx14 和Δ-9 FA 去饱和酶 SCD1 之间的功能性相互作用。蛋白质组 学和脂质组学确定了 SNX14-/-细胞的 FA 代谢和膜脂组成的能力扰乱。
邻近标记技术以及蛋白质组学和脂质组学分析揭示了 Snx14 在 FA 和 ER 内稳态中的作 用，为理解 ER-LD 接触点的蛋白质和脂肪生成反应提供见解。
2.Proximity labeling reveals non-centrosomal microtubule-organizing center components required for microtubule growth and localization. 2021, Current Biology, IF = 10.900
微管组织中心(MTOCs)是在活细胞内，能够起始微管的成核作用，并使之延伸的细胞结 构 。MTOC 的研究主要集中在中心体上，然而，大多数分化细胞采用非中心体 MTOCs (ncMTOCs)将其微管组织成不同的阵列，这对细胞功能至关重要。PTRN- 1/Patronin 是微管 负端蛋白，位于肠上皮细胞的顶端 ncMTOC 。为了鉴定 ncMTOC 的关键蛋白，该研究以 PTRN- 1/Patronin 为底物蛋白，构建其邻近标记体系，鉴定到了其近端蛋白 VABs- 10B/MACF1 以及 WDR-62 ，是两个重要的保守的蛋白。研究发现 VAB- 10B 和 WDR-62 与中心体无关， 专门调控非中心体微管和微管负端蛋白的顶端靶向。VAB- 10B 的缺失导致微管定位错误和 微管成核复合物ɣ-tubulin 环复合物(γ-TuRC)的延迟定位，而 WDR-62 的缺失则减少了动态微 管的数量，取消了γ-TuRC 定位。这种调节发生在细胞极性的下游，并与肌动蛋白一起发生。 该研究利用邻近标记技术确定了ncMTOC 的重要成分，并提示微管生长和定位受到明显调 控的分工。
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