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DNA 甲基化是最早被发现、也是研究最深入的表观遗传调控机制之一。广义上的 DNA 甲基化是指 DNA 序列上特定的碱基,在 DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化作用下,以 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)作为甲基供体,通过共价键结合的方式获得一个甲基基团的化学修饰过程。这种 DNA 甲基化修饰可以发生在胞嘧啶的 C-5 位、腺嘌呤的 N-6 位以及鸟嘌呤的 G-7 位等位点。一般研究中涉及的 DNA 甲基化主要指发生在 CpG 二核苷酸中胞嘧啶上第 5 位碳原子的甲基化过程,其产物称为 5-甲基胞嘧啶(5-mC),是植物、动物等真核生物 DNA 甲基化的主要形式,也是哺乳动物 DNA 甲基化的唯一形式。
因此,5-甲基胞嘧啶(或称甲基组)在全基因组分布备受关注。而全基因组甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing,WGBS)是通过亚硫酸氢盐( Bisulfite) 处理将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶,甲基化的胞嘧啶则保持不变,PCR扩增所需片段,尿嘧啶则全部转化成胸腺嘧啶。 对PCR产物进行高通量测序,与参考序列比对,即可判断CG/CHG/CHH位点是否发生甲基化。(H = A、T 或 C)

全基因组甲基化测序将重亚硫酸盐处理方法和高通量测序技术相结合,可对有参考基因组信息的物种实现全基因组范围内的,单碱基分辨的甲基化检测。
1. 研究不同细胞类型、组织或发育阶段之间的DNA甲基化差异,揭示基因表达调控、细胞分化、发育和疾病等方面的表观机制;
2. 比较正常和疾病状态下的DNA甲基化模式,以找出与疾病发生和进展相关的甲基化变化;
3. 研究个体之间的DNA甲基化差异,了解甲基化在人群中的遗传变异;
4. 比较外部环境因素(如营养、毒素、药物等)如何通过甲基化改变基因表达,从而影响个体的生理和疾病风险。
1.新鲜动物、肿瘤组织:>0.2g,液氮速冻,干冰邮寄;
2.细胞样品:>5×10^6 个;
3.全血样本::≥1mL,EDTA 抗凝,干冰寄送;
4.自提取DNA样品:要求总量≥1μg、浓度≥15ng/μl、主峰>20Kb、无蛋白,RNA/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠;附上凝胶电泳、NanoD opT、Qubit ®、Agilent Bioanalyze等其中至少一种的检测结果,电泳图需标明所用marker的条带大小。

TET 依赖的 DNA 去甲基化通路是视网膜发育(尤其感光细胞成熟)的关键调控机制

文章题目:Genetic ablation of the TET family in retinal progenitor cells impairs photoreceptor development and leads to blindness
期刊:PNASPPPPPSANPPNASPNAS(Q1, IF=9.1)
研究内容:研究通过构建视网膜祖细胞(RPCs)特异性 TET 家族敲除小鼠,发现 TET 家族是视杆 / 视锥感光细胞发育和功能的关键 —— 其缺失会导致感光细胞特化、成熟相关基因(如 Nr2e3、Rho)的启动子无法去甲基化,基因表达沉默,进而引发感光细胞外节和突触发育异常、缓慢凋亡,最终导致小鼠功能性失明。

实验设计:研究分离出生后第14天的Chx10-TET小鼠视网膜进行WGBS分析, 与对照小鼠视网膜全基因组甲基化模式进行对比,Chx10-TET小鼠中,视杆、锥特化、成熟基因(Nr2e3/Rho等)启动子高甲基化,启动子高甲基化对应基因低表达。
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