天津中医药大学Advanced Science：木香活性成分泽兰内酯共价靶向PKM2、通过增强Uhrf1介导的PKM2泛素化降解，以缓解炎症性肠病
发布时间：
2026-08-31
炎症性肠病（IBD）是免疫介导的慢性复发性肠道炎症，天津中医药大学孙成鹏教授团队前期研究证实，传统中药木香可通过双重免疫调节作用改善IBD：抑制肠道巨噬细胞/中性粒细胞浸润，同时恢复Th17/Treg免疫稳态。
8月17日，该团队筛出木香活性分子泽兰内酯（EPT），用化学蛋白质组学+APEX2邻近标记发现：EPT通过共价结合PKM2，增强其与E3连接酶Uhrf1的互作，介导PKM2泛素化降解、阻断其核转位，进而恢复Th17/Treg平衡、抑制NF-κB/NLRP3焦亡轴以缓解IBD。
文章信息
标题：Uhrf1-Mediated PKM2 Degradation via Ubiquitination Alleviates Inflammation and Pyroptosis in Inflammatory Bowel Disease
译名：Uhrf1介导的PKM2泛素化降解缓解炎症性肠病的炎症与焦亡
影响因子：IF=14.1/Q1
期刊：Advanced Science
发表时间：2026年8月17日
思路拆解
第一步：病理机制确证——scRNA-seq揭示IBD免疫失衡与代谢重编程
IBD的病理机制复杂，首先需要明确关键的细胞亚群和通路变化：
scRNA-seq分析（GSE282122）：质控聚类得9类细胞；IBD组B细胞、内皮、巨噬细胞、平滑肌、T细胞比例升高，上皮与浆细胞下降（图1A-E）。
失衡定位：T细胞亚群分析显示Th17/Treg比值在IBD患者显著失衡；RELA(p65)、NLRP3在多细胞群高表达（图1F-I）。
通路富集：GSEA显示IBD中丙酮酸代谢与经典NF-κB级联显著激活（图1J-K）。
小结：单细胞层面证实IBD的核心病理是Th17/Treg免疫失衡叠加NF-κB/NLRP3焦亡与丙酮酸代谢异常。
图1
第二步：核心成分体内药效评价与分子机制验证
从自建木香成分库筛出泽兰内酯（EPT），显示出抗IBD药效潜力：
整体表型：DSS-IBD模型隔日灌胃EPT 5/10/20 mg/kg，剂量依赖逆转体重下降及腹泻、直肠出血、DAI评分（图2B-C）。
形态与屏障：EPT剂量依赖延长结肠、减轻消化道出血并恢复血管完整性；HE与occludin染色示炎症浸润减少、隐窝结构保全、occludin上调，肠屏障加固；同时下调IL-6、IL-1β、CXCL10、CCL5等促炎因子mRNA（图2D-G）。
免疫平衡：EPT显著降低CD4+IL-17A+ Th17、升高CD4+CD25+Foxp3+ Treg；结肠与脾脏中RORc下降、Foxp3上升（图2H-K）。
通路验证：EPT下调iNOS、p-p65、cleaved caspase-1、GSDMD-N、ASC、NLRP3等NF-κB与NLRP3炎症小体组分，结肠切片免疫活性同步减弱（图2K）。
小结：木香来源小分子EPT通过抑制NF-κB驱动的炎症和NLRP3介导的焦亡，恢复Th17/Treg平衡，缓解IBD。
图2
第三步：体外功能验证——EPT的抗炎、抗焦亡及线粒体保护作用
在细胞水平进一步验证EPT的功能，并观察其对细胞器（线粒体）的影响：
抗炎：2 μM内无毒，剂量依赖性抑制LPS诱导的NO、IL-6、TNF-α释放及iNOS/COX-2/IL-1β/IL-6/CCL5等mRNA（图3A、D）。
抗焦亡：EPT减少IL-1β+与NLRP3+细胞、护线粒体膜电位，逆转LPS/NIG诱导的caspase-1活化、GSDMD裂解与NLRP3/GSDMD-N共定位，抑制焦亡（图3F-I）。
线粒体保护：EPT恢复线粒体融合蛋白Mfn1/Mfn2/Opa1、降低裂变蛋白Fis1与mtDNA释放，正常化钙内流与乳酸，逆转糖代谢重编程LDHA/HK2/GLUT1（图3B-C、E-H）。
小结：EPT在体外一并实现抗炎、抗NLRP3焦亡与线粒体动力学/代谢重编程保护。
图3
第四步：靶点垂钓与鉴定——PKM2是EPT的直接功能靶点
表型明确后，使用化学蛋白质组学鉴定EPT作用靶点：
靶钓：合成生物素化EPT探针进行pull-down，银染及LC-MS/MS鉴定58 kDa条带为PKM2（图4A-C）。
直接互作：DARTS/CETSA显示EPT剂量依赖性稳定PKM2抗酶解与热变性；免疫荧光显示共定位、MST测得结合高亲和Kd=106 nM（图4D-F）。
代谢重编程：Seahorse显示EPT逆转LPS所致的线粒体呼吸下降（基础呼吸、最大呼吸、ATP产量）和糖酵解升高（基础糖酵解、代偿性糖酵解）（图4G）。
临床关联：scRNA-seq显示PKM2在IBD成纤维细胞/T细胞等上调，血清ELISA约2倍升高、肠组织IHC中过表达（图4H-M）。
靶点功能：敲低PKM2可逆转LPS诱导的炎症因子升高及NF-κB/NLRP3激活，且EPT无额外保护作用；PKM2过表达加剧炎症并消除EPT的抑制作用（图5A-H）。
小结：EPT的直接结合靶点为PKM2，其疗效严格依赖PKM2。
图4
图5
第五步：结合位点鉴定——EPT共价修饰PKM2 C165
确定EPT与PKM2结合的具体氨基酸残基，解析构效关系：
结合位点：碘乙酰胺（IAA）预处理减少了Bio-EPT对PKM2的捕获，提示结合位点为半胱氨酸；LC-MS/MS发现EPT共价结合PKM2的C165、C474位点（图6A-C）。
突变体验证：构建C165A和C474A突变体，发现C165A突变破坏EPT与PKM2的结合，降低EPT对PKM2的热稳定性保护作用，并消除EPT的抗炎效果（图6D-F）。
结构印证：分子对接佐证EPT与PKM2 C165共价互作；在PKM2敲低细胞中回补C165A，EPT无法抑制LPS激活NF-κB/NLRP3与炎症（图6G-I）。
小结：PKM2 C165是EPT药理作用的关键结合位点。
图6
第六步：上游机制深挖——EPT促PKM2-Uhrf1结合，驱动K48泛素化降解PKM2
探究EPT结合PKM2后，是如何调控其PKM2蛋白水平的：
机制初探：EPT减弱LPS诱导的PKM2上调，抑制PKM2核转位；蛋白酶体抑制剂MG132可阻断EPT抑制作用，提示为蛋白酶体降解途径（图7A-C）。
挖互作者：APEX2邻近标记+LC-MS/MS得17个差异蛋白，火山图与点互作网络锁定E3连接酶Uhrf1；临床显示Uhrf1在IBD下调、与PKM2负相关（图7D-I）。
结合验证：Co-IP、MST证明EPT增强PKM2-Uhrf1互作，C165A突变消除EPT的增强作用；结构域映射发现PKM2 C端（389-531）结合Uhrf1 PHD结构域（305-418）（图7J-P）。
泛素化类型：Co-IP显示Uhrf1介导PKM2的K48连接多聚泛素化，EPT显著增强；K48R突变完全阻断（图7Q-S）。
Uhrf1必要性：敲低Uhrf1加剧LPS/LPS-NIG诱导的炎症与焦亡、促PKM2核转位，并在PKM2过表达细胞中削弱EPT的保护效力；外源过表达则相反（图8）。
小结：EPT结合PKM2后，增强Uhrf1-PKM2互作，诱导PKM2发生K48位泛素化降解、阻止其核转位；且EPT效应依赖于Uhrf1介导的PKM2泛素化。
图7
图8
第七步：体内靶点确证——PKM2敲除废除EPT抗IBD疗效与免疫重建
从细胞到活体，作者用慢病毒shPKM2敲除鼠做终极因果验证：
体内表型：尾静脉两次注射pLVX-shPKM2构建PKM2敲除鼠；DSS模型中PKM2 KO本身即改善体重/DAI、保全隐窝与结肠长度、降低炎性因子IL-6/IL-1β/CCL5/CXCL10（图9A-F）。
EPT无额外获益：PKM2敲除鼠中EPT不再提供额外治疗收益，证EPT抗IBD效应依赖PKM2（图9B-E）。
免疫重建：PKM2 KO降低脾脏Th17细胞、升Treg细胞，下调RORc/上调Foxp3，并抑制NF-κB/NLRP3通路；EPT对这些指标在KO鼠中无额外作用，证PKM2是EPT疗效的必需介质（图9G-L）。
小结：EPT改善IBD、恢复免疫平衡、抑制炎症焦亡的效应依赖于PKM2。
图9
研究亮点
- 靶点发现新颖：首次揭示天然产物泽兰内酯EPT通过共价结合PKM2的C165位点，发挥抗IBD作用，拓展了PKM2作为IBD治疗靶点的认知。
- 机制解析深入：利用APEX2邻近标记技术筛选出E3连接酶Uhrf1，阐明了EPT作为“分子胶”促进Uhrf1-PKM2相互作用，诱导K48位泛素化降解PKM2的全新机制。
- 视角创新：从“抑制PKM2酶活”转向“促进PKM2泛素化降解”，利用E3酶实现靶蛋白耗竭，为靶向“不可成药”蛋白提供新思路。
- 技术手段全面：整合了scRNA-seq、化学蛋白质组学/CETSA/DARTS/MST靶点确证、APEX2互作筛选、泛素化修饰分析及基因敲除小鼠验证，逻辑严密，证据链完整。
- 临床转化潜力：证实IBD患者血清和组织中PKM2高表达且与Uhrf1负相关，为EPT的临床应用提供了坚实的理论依据。
可延伸方向
- 药物延伸：基于EPT的结构进行优化，开发亲和力更高、特异性更强的PKM2降解剂（PROTACs）或分子胶药物。
- 机制延伸：可进一步探索Uhrf1上游的调控机制（如转录因子、非编码RNA），或研究PKM2泛素化与其他翻译后修饰（如乙酰化、乳酸化）的Crosstalk。
- 递送延伸：针对IBD的肠道局部病变特点，可设计EPT的结肠靶向递送系统（如纳米粒、水凝胶），以提高疗效并降低副作用。
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